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蛋白分離提取技術(shù)

發(fā)布時(shí)間: 2014-07-31 09:47:19  |   次瀏覽

別離蛋白質(zhì)的辦法有許多種,應(yīng)依據(jù)原材料和生產(chǎn)條件來挑選詳細(xì)的別離純化辦法。例如:李鳳英等[5]用鹽溶法獲取葡萄籽的蛋白質(zhì)。李喜紅等[6]用酶法從脫脂米糠中獲取蛋白質(zhì)。郭榮榮等[7]堿法與酶法與酶法獲取大米蛋白技術(shù)及功用特性對(duì)比研討得出結(jié)論是堿法獲取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性優(yōu)于酶法獲取的大米蛋白,而酶法獲取的大米蛋白的溶解性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于堿法獲取的大米蛋白。王桃云等[8]即是運(yùn)用這種辦法合作運(yùn)用加熱法獲取葎草葉蛋白。陳申如等[9]用酸法獲取了鰱魚魚肉蛋白質(zhì),獲取的蛋白質(zhì)無腥味,色澤皎白,蛋白質(zhì)產(chǎn)率高,可達(dá)90%擺布。以下介紹四種別離純化蛋白質(zhì)的辦法。 ?
1區(qū)帶離心法?
? ? 區(qū)帶離心法是別離蛋白質(zhì)的有用并且常用的辦法。該法的第一步是在離心管中構(gòu)成一個(gè)密度梯度(常用蔗糖梯度),然后將待別離的蛋白質(zhì)混合液放在密度梯度頂端。超速離心時(shí),蛋白質(zhì)即通過密度梯度移動(dòng),并依據(jù)其沉降系數(shù)而被分隔,最終各種蛋自質(zhì)在離心管內(nèi)被別離成各戶獨(dú)立的區(qū)帶,能夠在管底刺一小孔逐滴放出,分部搜集。?
2 層析法 ?
? ? 最常用的層析法是凝膠過濾和離子交流柱層析。 2.1 ?凝膠過濾(GFC)[10-12]?
? ? 凝膠過濾也叫凝膠色譜和分子篩層析,是運(yùn)用凝膠的網(wǎng)狀構(gòu)造依據(jù)分子的巨細(xì)和形狀進(jìn)行別離的辦法。凝膠過濾是一種疾速而簡(jiǎn)潔的別離剖析技術(shù),可用于蛋白質(zhì)的脫鹽、別離、提純、剖析等等。柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物,最常用的是葡聚糖凝膠〔其他有聚丙烯酞胺凝膠和瓊脂糖凝膠等)。仙聚糖凝膠是具有不一樣交聯(lián)度的網(wǎng)狀構(gòu)造物,不一樣類型的葡聚糖凝膠其“網(wǎng)眼”巨細(xì)不一樣,能夠用來別離純化不一樣分子巨細(xì)的物質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過層析柱時(shí),比“網(wǎng)眼”大的蛋自質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,不能沿著顆粒間隙活動(dòng),流程短,流速快,最先流出柱外;比“網(wǎng)眼”小的分子則進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,沿著孔道移動(dòng),從一個(gè)顆粒流出,又進(jìn)入另一顆粒,所以下移速度慢,隨后被洗脫下來。這樣,不一樣分子巨細(xì)的蛋白質(zhì)因?yàn)榱鹘?jīng)間隔不一樣而得到別離。依據(jù)欲別離蛋白質(zhì)混合物的相對(duì)分子質(zhì)量的上限和下限挑選合適的凝膠[13]。凝膠過濾因?yàn)樯蠘恿吭獾街搀w積約束,常用在純化道路的最終一步,此刻的樣品蛋白溶液雜質(zhì)量很低了,通過凝膠過濾就可純化。當(dāng)然,依據(jù)樣品蛋白溶液的特征,也有把凝膠過濾放在提純開始過程中的[14]。?
? ? 而在在基因工程藥物蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中,必需要采取一些合理的措施維護(hù)意圖蛋白質(zhì)的活性及穩(wěn)定性,如在緩沖液中增加還原劑(如二硫蘇糖醇)阻止巰基基團(tuán)被氧化,增加蛋白酶抑制劑避免蛋白質(zhì)的降解,增加金屬鰲合劑(如EDTA)除掉重金屬離子等,保持蛋白質(zhì)的構(gòu)造并保離子交流是指液相中的離子與固相(交流劑)上活性基團(tuán)離子的可逆交流反響,運(yùn)用此反響即將別離的混合物先在一定pH值的溶液中悉數(shù)解離,然后流過固相使之與固相上的離子進(jìn)行交流,吸附于固相上。再依據(jù)混合物中各組分解離度的不一樣,用不一樣pH值的溶液別離洗脫下來。離子交流還能夠與其他辦法聯(lián)系運(yùn)用。例如HirokiTsukamoto等[24]運(yùn)用凝血酶和離子交流色譜成功別離純化了交融蛋白。?
? ? 別離蛋自質(zhì)常用的交流劑是纖維素離子交流劑。在纖維素上引進(jìn)不一樣的活性基團(tuán)(分 酸性和堿性),即變成不一樣類型的離子交流劑,其間,酸性基團(tuán)能解離出H+于溶液中的陽 離子交流,稱為陽離子交流劑;堿性基團(tuán)能解離出OH一與溶液中的陰離子交流,稱為陰 離子交流劑。常用的陽離子交流劑是弱酸型能羧甲基纖維素(CM一纖維素),陰離子交流 劑是弱堿型的二乙氨基乙基纖維素(DEAE一纖維素)。纖維素離子交流劑對(duì)蛋白質(zhì)的交流容量大,分辨率高,能取得較好的別離作用及較高的回收率。此外,在與液相中的離子交流后,對(duì)離子的吸附力較弱,在較溫文的條件下即可被洗脫下來,不影響蛋白質(zhì)的活性。蛋白質(zhì)混合物的別離可由改變?nèi)芤褐宣}類離子強(qiáng)度和pH來完成,對(duì)離子交流劑聯(lián)系力最小的蛋白質(zhì)首要被洗脫下來。離子交流層析的一個(gè)重要改善是:把離子交流和分子排阻兩種效應(yīng)聯(lián)系起來,用于這種層析的材料有DEAE一葡聚糖。

持其活性[15、
16]。?
2.2 離子交流柱層析[17、礦山泥漿處理設(shè)備
18]?
離子交流色譜廣泛地應(yīng)用于別離各種生物大分子,且在實(shí)際工業(yè)純化過程中包含一步或幾步離子交流的過程[19]。傳統(tǒng)的離子交流色譜通常選用多糖類凝膠作為基質(zhì),存在機(jī)械強(qiáng)度差、接受壓力小等缺點(diǎn),不能進(jìn)行疾速淋洗,且別離時(shí)間長,易形成生物分子的變性、失活。無機(jī)硅膠[20]填料機(jī)械強(qiáng)度大、柱效高、孔徑和顆粒巨細(xì)易于控制,但PH應(yīng)用范圍窄(2.0-8.0),在蛋白質(zhì)別離過程中硅膠外表剩余的硅羥基對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)作不可逆吸附等缺點(diǎn),然后致使蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率低,生物活性損失。硅膠涂敷固定相[21]在連續(xù)運(yùn)用中涂層易
掉落、穩(wěn)定性差。.聚合物基質(zhì)[22、
23]固定相具有杰出的生物兼容性、化學(xué)穩(wěn)定性及易于被衍生化的長處,在生物大分子別離中的位置越來越重要。它的親水性減小了基質(zhì)與蛋白之間發(fā)作非特異性相互作用的時(shí)機(jī),也可在PH=1一12內(nèi)廣泛運(yùn)用。
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